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IgG lieferte keine Signale, die auf puma basket beige eine Immunpräzipitationsspezifität hinweisen. Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung wurde über Reverse IP unter Verwendung eines PUMA-Antikörpers bestätigt (Fig. S2 in Supplemental Data). Ein früherer Bericht [36] zeigte, dass EGFR im Zytoplasma in freier, nicht membrangebundener Form vorliegen kann. In diesem Zusammenhang wird aktiviertes EGFR auf der Zelloberfläche endozytiert und zum ER transportiert, wo es mit Sec61beta, einer Komponente des Sec61-Translokons, assoziiert und dann als nicht membrangebundener Rezeptor vom ER zum Zytoplasma retrotransloziert wird. [37] . Unsere Ergebnisse in Abb. S2 in Supplemental Data zeigen, dass PUMA hauptsächlich mit dem EGFR-Protein interagiert, das nicht mit Plasmamembranen assoziiert ist.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass EGFR und EGFRvIII beide paradoxerweise mit proapoptotischen Proteinen koexprimieren und spezifisch mit PUMA in menschlichem GBM interagieren. Unter Verwendung einer Kohorte von 101 Gliomen und 12 normalen Hirngeweben untersuchten wir die Spiegel von EGFR / EGFRvIII und puma basket black PUMA über IHC . Die Ergebnisse zeigen eine signifikante positive Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von EGFR / EGFRvIII und PUMA (p = 0,039). Wie in 2a gezeigt, ist das Ausmaß der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Coexpression bei hochgradigen / malignen Gliomen (20% bei AAs und 34,1% bei GBMs) signifikant puma basket bow höher als bei niedriggradigen Gliomen (6,3-7,7%). ) und normales Hirngewebe (0%).

U87MG-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. (B) Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht GBM-Zellen eine Resistenz puma basket classic damen gegen Apoptose.

Nach der Behandlung mit Anisomycin gab es nur 3,1% Apoptose in U87MG-EGFRvIII-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten die isogenen U87MG-Vektorzellen mit niedrigem EGFR-Gehalt eine massive Apoptose (49,8%), ähnlich wie bei der PUMA-Herunterregulierung (45,5%). Die Ergebnisse in 3 zeigen zusammengenommen, dass die GBM-Apoptose durch PUMA positiv reguliert und durch EGFR / EGFRvIII negativ beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass die PUMA- und EGFR / EGFRvIII-Pfade funktionell aber umgekehrt mit der Apoptose in GBM-Zellen verbunden sind. 4 zeigen, dass in GBM-Zellen EGFR / EGFRvIII und PUMA unter nicht belasteten Bedingungen einen Komplex bilden und dass der Komplex auch nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktor Staurosporin (ST) erhalten bleibt.

PUMA ist im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, mtPUMA-Index, wird wie unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. Mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelte U87MG-EGFRvIII-Zellen wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. Proteinextrakte aus beiden Fraktionen wurden einem Western Blot unterzogen, um PUMA, ±-Tubulin (cytoplasmatischer puma basket grau Marker) und Cox IV (mitochondriales Protein) nachzuweisen.

PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter unbelasteten und gestressten Bedingungen lokalisiert, was durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt wird. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in T98G-GBM-Zellen gefunden, die auf natürliche Weise EGFR exprimieren (5c). Der bescheidene Nachweis von mitochondrialem PUMA in diesen Zellen kann möglicherweise das Ergebnis einer unzureichenden zytoplasmatischen EGFR sein, um mit allen PUMA-Molekülen im Zytoplasma zu interagieren und diese zu sequestrieren. Wichtig ist, dass der siRNA-vermittelte Abbau der EGFR-Expression zu einem signifikanten Anstieg (16-fach) des mitochondrialen PUMA führte (Abb. 5c-links), was weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung modulieren kann.